himac APPLICATION
No.77 MARCH 1997
ネオアングルロータによる株化細胞からのRNA分離
機種：小形超遠心機用S100NTネオアングルロータ
小形超遠心機用S100NTネオアングルロータを用いて株化細胞UT－7からRNAを抽出し、RT－PCR法により血小板第4因子（Platelet Factor 4: PF4）遺伝子を増幅、合成した例
従来RNAの分離はスイングロータを用いて、一晩（約20時間）程度超遠心分離する手法が一般的でした。
これに対し、当社ではロータの高回転化やアングルロータの応用により、遠心時間の短縮化を検討してきました。*1, 2)
今回はアングルロータよりも沈降距離の短いネオアングルロータを用いることにより、さらなる迅速化を検討しました。
また、ここでは分離したRNAを用いたRT-PCR法により血小板第4因子（Platelet Factor 4 :
PF4）遺伝子*3)の増幅、合成を行い、スイングロータにより分離したRNAと同様に実験が可能なことを示しました。
1. 実験結果
(1) サンプル：巨核芽球性白血病由来株化細胞UT-7 *4)
(2) 遠心条件
| ロータ | 回転速度 | 遠心時間 | 温度 | Accel. | Decel. |
|---|---|---|---|---|---|
| S100NT ネオアングルロータ |
100,000rpm | 4時間 | 15ºC | 5 | 7 |
(3) 電気泳動結果
RNA15μgを使用し、1.0％Agarose－Formaldehyde gel 電気泳動を約16時間行いました。（図1）
(4) RT－PCR法によるPF4遺伝子の増幅 *5, 6)
本ロータを用いて分離したRNA2μgから逆転写酵素によりcDNAを合成し、さらにPF4遺伝子のプライマーを用いたPCR反応からPF4遺伝子を合成しました。（図2）
2. RNA超遠心分離手法
(1) Cell pellet（5～10×106 cells）
↓ ←Lysate 4M GTC sol 2.7ml
(2) 5.7M CsCl 1.3ml 上に重層（4PAアツチューブ）
(3) 超遠心分離
↓ ←Dissolve 150μl ETS buffer×3
(4) エタノール沈殿
(5) Dissolve l0～20μl DEPC'd DDW
- 本実験は自治医科大学・血液学教室及び血液学研究部門・造血発生教室との共同研究によるものであり、この応用例が以下に報告されています。*5, 6)
（参考文献）
- HIMAC APPLICATION No. 55（1993）.
- HIMAC APPLICATION No. 56（1993）.
- Poncz N., et al., Blood, 69 , 219（1987）.
- Komatsu N., et al., Cancer Res., 51 ,341（1991）.
- 菊池次郎ほか、第58回日本血液学会抄録集（1996）.
- Kikuchi J., Furukawa Y., et al., Blood, 89, 3980（1997）.