himac APPLICATION
No.66 DECEMBER 1994
himac エルトリエータ細胞分離システムによるApoptotic cellの分離
機種：高速冷却遠心機用SRR6Y形エルトリエータロータ
himac エルトリエータ細胞分離システムを用いて、株化細胞HL-60のApoptotic cellを分離した例
himac エルトリエータ細胞分離システムは遠心力だけでなく、遠心力に対抗する流れの力と力との二つの力を利用して、細胞レベルの大きさのもの（2～50μｍ程度）を分離するシステムです。
このシステムを利用すると、遠心力だけでは難しい細胞のサイズごとの分離が可能となります。
そのため、従来困難であったHL-60*1)など株化細胞の増殖や分化の過程において生じるさまざまな細胞中からの、Apoptotic
cell*の分離に有効となります。*2)
また、本システムによる分離では、細胞に物理的、代謝的に損傷を与えることなく、短時間に高純度、高回周率で分離が可能です。
1. 分離結果
フラクション1にApoptotic cellがおよそ90％の純度で得られました。
以下に分離前（Fig．1）とフラクション1（Fig．2）で得られた細胞のフローサイトメトリー測定結果を示す。
（Propidium Iodide staining and Becton Dickinson flow cytometry analyzer analysis；
FACScan，Becton Dickinson）
- 形態や免疫系形成時等に細胞にあらかじめ記憶された細胞死の機構（プログラムド細胞死）に基づき死滅した細胞。これらの細胞は死滅する過程において細胞や核の凝集、染色体DNAの断片化を伴うことが知られている。
表1. 分離条件と結果の一覧表
| フラクション | 回転速度 (rpm) |
流量 (ml/min) |
分画時間 (min) |
分画量 (ml) |
細胞数 (×107コ) |
細胞の割合 (％) |
備考 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 分離前 | - | - | - | - | 12.0 | - | Fig.1 |
| 1 | 2,000 | 14 | 14.3 | 200 | 1.2 | Apoptotic Cell ：90％ |
Fig.2 |
| 2 | 2,000 | 17 | 11.8 | 200 | 1.6 | - | |
| 3 | 2,000 | 19 | 10.5 | 200 | 1.9 | G0／G1：90％ | |
| 4 | 2,000 | 21 | 9.5 | 200 | 1.3 | Ｓ：70％ | |
| 5 | 2,000 | 23 | 8.7 | 200 | 0.9 | - | |
| 6 | 2,000 | 25 | 8.0 | 200 | 0.5 | G2／Ｍ：80％ | |
| 合 計 | - | - | 62.8 | 1,200 | 7.4 | - |
2. 分離方法
(1) サンプル：ヒト前骨髄性白血病由来細胞株HL－60、1.2×108cells
（Calcium Ionophore 4h stimulated*3)）
(2) PBS（Dulbecco`s PBS）、0.01％（w／v）EDTA－2Na及び1％（v／v）FBS添加
(3) 分離手順
- CF7D小形冷却遠心機を用い、1,000rpm、10分（4℃）遠心し、細胞を集める。
- PBSバッファ10mlに再懸濁する。
- 回転速度2,000rpm、流量14ml／minでサンプルを供給し、表1に示した条件で分離する。
- 本実験は自治医科大学・血液学研究部門・造血発生学教室との共同研究によるものであり、この応用例が第56回日本血液学会抄録集において発表されています4)。
（参考文献）
- Collins S．J., Gallo R., Gallagher R．E., Nature，270，347（1977）．
- Terui Y., Furukawa Y., Kikuchi J., Saito M., J．cell．Physiol．, 164, 74 (1995)．
- Wyllie A．H., Morris R．G., smith A．L., Dunlop D., J．Pathol., 142, 67（1984）．
- 照井康仁ほか、第56回日本血液学会抄録集，p.154（1994）．