himac APPLICATION

No.65 DECEMBER 1994

himac エルトリエータ細胞分離システムによる株化細胞HL-60の分離

機種：高速冷却遠心機用SRR6Y形エルトリエータロータ

himac エルトリエータ細胞分離システムを用いて、株化細胞HL-60を細胞周期毎に分離した例

himac エルトリエータ細胞分離システムは遠心力だけでなく、遠心力に対抗する流れの力との二つの力を利用して、細胞レベルの大きさのもの（2～50μm程度）を分離するシステムです。
このシステムを利用すると、遠心力だけでは難しい細胞のサイズごとの分離が可能となります。
そのため、HL-60*1)など株化細胞の増殖の際に生じる各増殖段階の中から、同一周期にある細胞の分離に有効となります。従来のアフィディコリンのようなDNA合成阻害剤などを用いる必要がないため、細胞に物理的、代謝的に損害を与えることがなく、短時間にいくつかの周期の細胞を高純度、高回収率で分離することが可能です*2)。

1. 分離結果

  1. フラクション1と2に G0／G1期の細胞がほぼ100％の純度で得られました。
  2. フラクション3にS期の細胞が72％の純度で得られました。
  3. フラクション6に G2／M期の細胞が90％の純度で得られました。

以下に分離前(Fig.1)、フラクション2(Fig.2)、フラクション3(Fig.3)、フラクション6(Fig.4)に得られた細胞のフローサイトメトリー測定結果を示します。
（Propidium Iodide staining and Becton Dickinson flow cytometry analyzer analysis; FACScan, Becton Dickinson）

表1. 分離条件と結果の一覧表

フラクション 回転速度
(rpm)		 流量
(ml/min)		 分画時間
(min)		 分画量
(ml)		 細胞数
(×107コ)		 細胞の割合
(％)		 備考
分離前 - - - - 18.0 G0/G1：38％
Ｓ：40％
G2／Ｍ：20％		 Fig.1
1 2,000 17 11.8 200 1.4 G0/G1：100％ Fig.2
2 2,000 19 10.5 200 4.6 -  
3 2,000 21 9.5 200 2.3 Ｓ：40％ Fig.3
4 2,000 23 8.7 200 1.9 -  
5 2,000 25 8.0 200 1.2 G2／Ｍ：90％  
6 2,000 27 7.4 200 0.6 G2／Ｍ：90％ Fig.4
合計 - - 55.9 1,200 12.0 -  

表2. G0／G1期細をDNA合成阻害剤により得た時との比較

  純度 Viability 備考
エルトリエータ
細胞分離システム		 100％ 100％ Fig.5
DNA合成阻害剤※ 80％ 80％ Fig.6
  • Aphidicolin 2.5（μg／ml）over night incubation（37℃）*3)

2. 分離方法

(1) ヒト前骨髄性白血病由来細胞株 HL-60、1.8×108cells
(2) PBS（Dulbecco's PBS）、0.01％（w/v）EDTA－2Na 及び1％（v/v）FBS添加

(3) 分離手順

  1. CF7D 小型冷却遠心機を用い、1,000rpm、10分（4℃）遠心し、細胞を集める。
  2. PBSバッファ 10ml に再懸濁する。
  3. 回転速度 2,000rpm、流量 14ml／min でサンプルを供給し、100ml 程分画した後、表1に示した条件で分離を行う。
  • 本実験は自治医科大学・血液学研究部門・造血発生学教室との共同研究によるものであり、 この応用例が第56回日本血液学会総会において発表されています 4)。

（参考文献）

  1. Collins S. J., Gallo R., Gallagher R.E., Nature, 270, 347（1977）．
  2. Terui Y., Furukawa Y., Kikuchi J., Saito M., J.Cell. Physiol.,164, 74 (1995)．
  3. 奥田篤行・木村元喜：動物細胞利用実例化マニュアル, p.200－215, リアライズ社（1984）．
  4. 照井康仁ほか、第56回日本血液学会抄録集, p154（1977）．