himac APPLICATION
No.60 APRIL 1994
ネオアングルロータを用いたプラスミドDNAの迅速分離 (2)
機種：CS120FX形分離用小形超遠心機/RP120NTネオアングルロータ
チューブ容量2mlのRP120NTネオアングルロータを用いて２－ステップ勾配法により大腸菌のプラスミドDNAを１時間で分離した例
RP120NTネオアングルロータでの均一液法によるプラスミドDNAの分離時間については、すでにアプリケイションNo.59において２時間と報告しています。
しかし、ここではさらに短い時間での分離例として、２－ステップ勾配法により遠心分離時間がわずか１時間の例を示します。
分離結果
実験条件
(1) 遠心分離条件
| ロータ | 回転速度 | 遠心時間 | 温度 | 加速モード | 減速モード |
|---|---|---|---|---|---|
| RP120NT ネオアングルロータ |
120,000rpm | 1時間 | 20ºC | 9 | 7 |
(2) 使用チューブ: 2PAシールチューブ
(3) 試料調製法
プラスミドpUC19DNAを含む大腸菌JM109を一夜振盪培養後、アルカリ－SDS法などにより得られたプラスミドDNAを含むTE溶液（10mM Tris－HCl，1mM
EDTA）を試料とします。
2PAシールチューブ1本あたり
（低密度液：上層）
42％(w/w)塩化セシウム／TE緩衝液（pH8.0）：約0.9ml
（高密度液：下層）
試料：0.62ml
塩化セシウム：0.98g
臭化エチジウム（10mg/ml）：40μl
ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル（Triton X-100）：2μl
-
低密度液0.9mlを注射器を用いて2PAシールチューブに注入します。
次にプラスミドDNAを含む高密度液約0.9mlをチューブの底より静かに注入します。注入はチューブ底まで届くような注射針を注射器に装着して行なって下さい。（右図参照）
以上でチューブが満たされない場合には、チューブの上から低密度液を静かに注入し、チューブを満たして下さい。
注入の終わったチューブはSTF-1形チューブシーラを用いて注入口を溶着します。
この際に低密度液と高密度液の界面を乱さないように静かに取扱って下さい。