himac APPLICATION
No.100 DECEMBER 1999
エルトリエータ細胞分離システムを用いて、マウス骨髄から血液幹細胞を分離濃縮した例
機種:R5E形エルトリエータ細胞分離システム
エルトリエータ細胞分離システムを用いてマウス骨髄から赤血球を除去し、血液幹細胞(CD34陰性、c-kit陽性、Sca-1陽性、Lineage陰性
細胞)を約4倍の濃度に、セルソータにアプライする前の細胞数を約1/4まで濃縮しました。
血液幹細胞の分離は幹細胞研究の進展に伴い、近年盛んに行われるようになりました。この際、幹細胞の分離は、細胞表面マーカによるフローサイトメトリー法(セルソータ)が用いられております。
しかしながら、分離における回収率、細胞生存率の低さや分離に長時間を要する等の問題から、その効率化が望まれておりました。そこで、エルトリエータ細胞分離システムを前処理に用いて、骨髄細胞中の幹細胞を濃縮し、セルソータによる分離の効率化を図りました。
1. 分離条件および結果
サンプル:マウス骨髄細胞 約1×108個(幹細胞*純度:約0.1%)
(*幹細胞1):CD34陰性、c-Kit陽性、Sca-1陽性、Lineage陰性 細胞)
Fr. No. | 流量 | 分画量 | 回収全細胞数 | 幹細胞数 | 幹細胞純度 |
---|---|---|---|---|---|
1 | 15ml/min | 200ml | (全赤血球) | 0 | 0% |
2 | 20ml/min | 200ml | 7.0×106 cells | 9,800 | 0.14% |
3 | 25ml/min | 200ml | 1.5×107 cells | 58,500 | 0.39% |
4 | 30ml/min | 200ml | 9×106 cells | 36,000 | 0.40% |
5 | 35ml/min | 200ml | 3.3×107 cells | 0 | 0% |
Total | - | 1000ml | 6.4×107 cells | 105,200 | - |
(回転速度:3,000rpm)
表2 分離結果まとめ
分離前 | 分離後 (Fr.No.3,4) | 濃縮率/回収率 | |
---|---|---|---|
全細胞数 | 1.0×108 cells | 2.4×107 cells | 1/4 |
幹細胞純度 | 0.1% | 0.4% | 4倍 |
幹細胞数 | 約1×105 cells | 9.5×104 cells | 約95% |
2. 分離方法
- マウス骨髄液の採取
- PBS(-)で洗浄し、10~15mlに懸濁
- エルトリエータ細胞分離システムによる分離
- フローサイトメトリー法による分離(Becton Dickinson社製FACS Vantage)
- 血液幹細胞
3. 使用機種
遠心機 :CR-F/Gシリーズ himac 高速冷却遠心機
ロータ :R5E形エルトリエータロータ
チャンバ :スタンダードチャンバ
4. References
- Osawa M, Hanada ft Hamada H, Nakauchi H., Science,273,242-245 (1006).
- Uchida N., et al., Exp.Hematol.,24,649-669 (1996).
- Ortiz M., et al., Immuniff,10,173-182 (1990).
- 実験は筑波大学医学部・免疫学教室。中内教授のご協力により作成したものです。